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蛋白質

簡介   

蛋白,蛋白質,朊,有機大分子

一、蛋白質 蛋白質是由 氨基酸 以“ 脫水縮合 ”的方式組成的多 肽鏈 經過盤曲折疊形成的具有一定空間結構的物質。 蛋白質(protein)是 生命 的物質基礎,是有機大分子,是構成細胞的基本有機物,是生命活動的主要承擔者。氨基酸是蛋白質的基本組成單位。機體中的每一個細...查看詳情>>

蛋白質

簡介   

蛋白,蛋白質,朊,有機大分子

一、蛋白質


蛋白質是由氨基酸以“脫水縮合”的方式組成的多肽鏈經過盤曲折疊形成的具有一定空間結構的物質。


蛋白質(protein)是生命的物質基礎,是有機大分子,是構成細胞的基本有機物,是生命活動的主要承擔者。氨基酸是蛋白質的基本組成單位。機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。人體內蛋白質的種類很多,性質、功能各異,但都是由20多種氨基酸(Amino acid)按不同比例組合而成的,并在體內不斷進行代謝與更新。


蛋白質是由C()、H(氫)、O()、N(氮)組成,一般蛋白質可能還會含有P()、S(硫)、Fe(鐵)、Zn(鋅)、Cu(銅)、B()、Mn()、I()、Mo()等。


這些元素在蛋白質中的組成百分比約為:碳50% 氫7% 氧23% 氮16% 硫0~3% 其他微量。


(1)一切蛋白質都含N元素,且各種蛋白質的含氮量很接近,平均為16%


(2)蛋白質系數:任何生物樣品中每1g元N的存在,就表示大約有100/16=6.25g蛋白質的存在, 6.25常稱為蛋白質常數


二、檢測方法


食品中蛋白質的測定方法主要有凱氏定氮法,雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)、紫外吸收法和考馬斯亮藍法(Bradford法)


1.凱氏定氮法【GB/T 5009.5—1985】

實驗原理
蛋白質是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質分解,分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定,根據酸的消耗量乘以換算系數,即為蛋白質含量。


2.雙縮脲法(biuret法)


實驗原理

雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個分子脲經180℃左右加熱,放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能過一個中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。

紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1-10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有:硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。


此法的優點是較快速,不同的蛋白質產生顏色的深淺相近,以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質測定。


3.folin―酚試劑法(lowry法)


實驗原理

這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即folin―酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin―酚試劑中的磷鉬酸鹽―磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。


此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。


4.考馬斯亮蘭法(bradford法)


實驗原理

雙縮脲法(biuret法)和folin—酚試劑法(lowry法)的明顯缺點和許多限制,促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。

1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法(bradford法),是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點,因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。

考馬斯亮蘭g-250染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm變為595nm,溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為,染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。

在595nm下測定的吸光度值a595,與蛋白質濃度成正比。


bradford法的突出優點是:

(1)靈敏度高,據估計比lowry法約高四倍,其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大,蛋白質-染料復合物有更高的消光系數,因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比lowry法要大的多。

(2)測定快速、簡便,只需加一種試劑。完成一個樣品的測定,只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時內保持穩定,且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩定性最好。因而完全不用像lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。

(3)干擾物質少。如干擾lowry法的k+、Na+、mg2+離子、tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等均不干擾此測定法。

此法的缺點是:

(1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差,在制作標準曲線時通常選用g—球蛋白為標準蛋白質,以減少這方面的偏差。

(2)仍有一些物質干擾此法的測定,主要的干擾物質有:去污劑、triton x-100、十二烷基硫酸鈉(sds)和0.1n的NaOH。(如同0.1n的酸干擾lowary法一樣)。

(3)標準曲線也有輕微的非線性,因而不能用beer定律進行計算,而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。


6.紫外吸收法


實驗原理

蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質含量成正比。此外,蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下,蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系,可以進行蛋白質含量的測定。


紫外吸收法簡便、靈敏、快速,不消耗樣品,測定后仍能回收使用。低濃度的鹽,例如生化制備中常用的(NH42SO4等和大多數緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測,因為此時只需測定蛋白質濃度的變化,而不需知道其絕對值。


此法的特點是測定蛋白質含量的準確度較差,干擾物質多,在用標準曲線法測定蛋白質含量時,對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質,有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質,會出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表,再進行計算的方法,加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經過校正,測定的結果還是存在一定的誤差。


此外,進行紫外吸收法測定時,由于蛋白質吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。


三、國家標準


1 GB/T 24897-2010 糧油檢驗 稻谷粗蛋白質含量測定 近紅外法

2 GB/T 24899-2010 糧油檢驗 小麥粗蛋白質含量測定 近紅外法
3 GB/T 24901-2010 糧油檢驗 玉米粗蛋白質含量測定 近紅外法
4 GB/T 24870-2010 糧油檢驗 大豆粗蛋白質、粗脂肪含量的測定 近紅外法
5 GB/T 24871-2010 糧油檢驗 小麥粉粗蛋白質含量測定 近紅外法
6 GB 24788-2009 醫用手套表面殘余粉末、水抽提蛋白質限量
7 GB/T 24318-2009 杜馬斯燃燒法測定飼料原料中總氮含量及粗蛋白質的計算
8 GB/T 2910.4-2009 紡織品 定量化學分析 第4部分:某些蛋白質纖維與某些其他纖維的混合物(次氯酸鹽法)
9 GB/T 14489.2-2008 糧油檢驗 植物油料粗蛋白質的測定
10 GB/T 5511-2008 谷物和豆類 氮含量測定和粗蛋白質含量計算 凱氏法
11 GB/T 21870-2008 天然膠乳醫用手套水抽提蛋白質的測定 改進Lowry法
12 GB/T 17811-2008 動物性蛋白質飼料胃蛋白酶消化率的測定 過濾法
13 GB/T 19495.8-2004 轉基因產品檢測 蛋白質檢測方法
14 GB/T 18868-2002 飼料中水分、粗蛋白質、粗纖維、粗脂肪、賴氨酸、蛋氨酸快速測定 近紅外光譜法

收起百科↑ 最近更新:2017年11月09日

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